配子發(fā)生機制研究不僅是魚(yú)類(lèi)生殖生物學(xué)研究的重要命題，而且是突破魚(yú)類(lèi)借腹生殖等精準育種技術(shù)的科學(xué)需求。在魚(yú)類(lèi)雄性性腺中，精子發(fā)生過(guò)程包含有生殖細胞的有絲分裂和減數分裂，產(chǎn)生從精原細胞到精母細胞再到精子細胞的眾多生精細胞（spermatogenic cells）亞型。對這些不同亞型的生精細胞進(jìn)行精確鑒定，是魚(yú)類(lèi)精子發(fā)生研究的基礎。目前對魚(yú)類(lèi)生精細胞亞型的鑒定通?；诩毎凹毎说男螒B(tài)學(xué)特征，其準確性和可靠性強烈依賴(lài)于研究者的經(jīng)驗，很大程度上缺乏細胞生物學(xué)證據。理論上，利用生精細胞發(fā)育和分化過(guò)程中特征性蛋白的表達譜式，將能夠更加客觀(guān)和準確地鑒定不同亞型的生精細胞。然而，目前可用于魚(yú)類(lèi)生精細胞鑒定的工具抗體十分缺乏，加之現有的免疫熒光技術(shù)無(wú)法適應大數據驅動(dòng)的高通量研究新范式，嚴重阻礙了這一研究領(lǐng)域的發(fā)展。 

　　中國科院水生生物研究所孫永華團隊針對上述難題，系統開(kāi)發(fā)了特異性識別魚(yú)類(lèi)配子發(fā)生相關(guān)的Ddx4（Vasa）和Piwil1蛋白，以及減數分裂和有絲分裂相關(guān)的Sycp3和Pcna蛋白的一套多克隆抗體，并在此基礎上建立了一個(gè)適應于高通量操作的免疫熒光技術(shù)流程（圖1）。利用這些抗體和建立的高通量免疫熒光技術(shù)，該團隊精細鑒定了斑馬魚(yú)、稀有鮈鯽、鯉魚(yú)、團頭魴、草魚(yú)、黃鱔等多種魚(yú)類(lèi)的生精細胞亞型。 

圖1 抗體制備和優(yōu)化的免疫熒光技術(shù)流程，及抗體的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測  

　　該團隊以斑馬魚(yú)精巢為研究對象，通過(guò)Ddx4、Pcna、Sycp3及細胞核的四色免疫熒光共染實(shí)驗，實(shí)現一次性精細鑒定了13種不同亞型的生精細胞。它們分別是靜息態(tài)單細胞A型精原細胞quiescent SPG-A(1-cell)、有絲分裂態(tài)單細胞A型精原細胞mitotic SPG-A(1-cell)、精小囊中含有2、4或8個(gè)細胞的A型精原細胞SPG-A(2,4,8-cell)、精小囊中含有16或32個(gè)細胞的B型精原細胞SPG-B(16,32-cell)、精小囊中含有64、128或256個(gè)細胞的B型精原細胞SPG-B(64,128,256-cell)、細線(xiàn)期初級精母細胞SPC-I(L)、偶線(xiàn)早期初級精母細胞SPC-I(EZ)，偶線(xiàn)中晚期初級精母細胞SPC-I(MZ/LZ)、粗線(xiàn)期初級精母細胞SPC-I(P)、次級精母細胞SPC-II、精子細胞SPD和精子SPZ（圖2A-J）。最后，他們提出了基于細胞形態(tài)學(xué)和特征蛋白表達譜式來(lái)鑒定魚(yú)類(lèi)生精細胞13個(gè)亞型的新標準（圖2K）。 

　　值得一提的是，在斑馬魚(yú)精子發(fā)生領(lǐng)域，前人學(xué)者僅根據形態(tài)特征，就武斷地將SPG-A(1-cell)稱(chēng)作未分化的A型精原細胞（SPG-Aund），而將SGP-A(2,4,8-cell)統稱(chēng)為分化的A型精原細胞（SPG-Adiff），導致這一概念在領(lǐng)域內被廣為傳播。孫永華團隊通過(guò)上述生精細胞亞型鑒定的新標準，更正了這一領(lǐng)域長(cháng)久以來(lái)的錯誤定義，提出了更為客觀(guān)的命名標準，為深入開(kāi)展魚(yú)類(lèi)精原干細胞自我更新和分化研究提供了更加科學(xué)的定義和更為強大的工具。 

圖2 利用Ddx4、Pcna、Sycp3及細胞核的四色免疫熒光技術(shù)對不同亞型生精細胞進(jìn)行精確鑒定（A-J）），提出魚(yú)類(lèi)生精細胞亞型鑒定的新標準  

　　近日，相關(guān)研究成果在線(xiàn)發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊Frontiers in Endocrinology（https://doi.org/10.3389/fendo.2023.1044318）。水生所孫永華研究員為通訊作者，青年研究員葉鼎和碩士研究生劉濤為共同第一作者，水生所朱作言院士、胡煒研究員、汪亞平研究員等參與合作研究。該項研究獲得國家自然科學(xué)基金等資助，文中產(chǎn)生的各類(lèi)抗體資源已保藏至國家水生生物種質(zhì)資源庫國家斑馬魚(yú)資源中心。