新聞科研進(jìn)展
近日，武漢病毒所/華中科技大學(xué)/南開(kāi)大學(xué)聯(lián)合團隊在布尼亞病毒核酸內切酶的催化機制，以及基于結構的藥物干預機制研究中取得重要進(jìn)展。兩篇相關(guān)研究成果“Insights into two-mietal-ion catalytic mechanism of cap-snatching endonuclease of Ebinur Lake virus in Bunyavirales”，以及 “Structural and biochemical basis for development of diketo acid inhibitors targeting the cap snatching endonuclease of the Ebinur Lake virus (order: Bunyavirales)”相繼在線(xiàn)發(fā)表在Journal of Virology上。
布尼亞病毒包含許多重要的人和動(dòng)物病原，對公共健康和農牧業(yè)構成了嚴重威脅，目前尚未有針對該類(lèi)病毒的疫苗和特異性治療藥物。艾比湖病毒（Ebinur Lake virus，EBIV）是近年在我國新疆艾比湖地區發(fā)現的一種新型蚊媒布尼亞病毒，前期研究結果表明EBIV對我國人口健康構成潛在生物安全風(fēng)險。包括布尼亞病毒和流感病毒在內的分節段負鏈RNA病毒普遍利用一種獨特的“奪帽”機制來(lái)起始病毒的轉錄。奪帽過(guò)程由病毒編碼的L蛋白執行，該蛋白中段為依賴(lài)RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP），N端區域包含核酸內切酶（endonuclease，EN）結構域，C端區域包含帽子結合域（cap binding domain，CBD），在CBD的協(xié)同作用下，由EN實(shí)現宿主mRNA的切割。由于切割得到的含5'帽子結構的寡核苷酸被用作RdRP轉錄的引物，因此EN可作為重要的病毒干預靶點(diǎn)。
研究團隊首先解析了一系列高分辨率（2.0-2.6埃）的EBIV EN野生型和活性位點(diǎn)突變體晶體結構，并結合體外核酸內切酶生化實(shí)驗，深入分析了EN活性位點(diǎn)結構與功能之間的關(guān)系。研究結果顯示，EBIV EN是一種二價(jià)金屬離子依賴(lài)的RNA核酸內切酶，能特異性切割富含尿嘧啶且不含二級結構的單鏈RNA，其酶活嚴格依賴(lài)活性位點(diǎn)兩個(gè)金屬離子的結合（圖1）。EBIV EN野生型和突變體蛋白的晶體結構分析進(jìn)一步支持雙金屬離子催化機制，且兩個(gè)金屬離子在活性位點(diǎn)上的結合具有相關(guān)性。該研究為深入理解分節段負鏈 RNA 病毒核酸內切酶的工作機制提供了重要證據。
圖1. EBIV EN的活性依賴(lài)于活性位點(diǎn)兩個(gè)二價(jià)金屬離子的結合。（A）EBIV EN活性位點(diǎn)區域的立體對象圖。（B）EBIV EN 野生型和活性位點(diǎn)突變體的核酸內切酶活性分析。
在此基礎上，研究團隊進(jìn)一步對EBIV EN的干預機制進(jìn)行了研究。研究團隊首先以EN金屬螯合型抑制劑二酮酸類(lèi)化合物L(fēng)-742,001為原型，設計和合成了一系列衍生化合物，隨后結合酶學(xué)，病毒學(xué)和晶體學(xué)方法對這些化合物的構效關(guān)系進(jìn)行了深入探究。研究結果表明，L-742,001及其9種衍生物能以不同程度抑制EBIV EN的體外酶活和細胞水平上的病毒復制。EN與抑制劑復合物晶體結構分析（圖2）進(jìn)一步顯示，L-742,001的二酮酯基團通過(guò)金屬螯合作用占據EN的活性中心，對氯苯基團則與活性位點(diǎn)殘基形成穩定的疏水堆積作用，二者對其活性至關(guān)重要；其苯基由于結構上的靈活性和結合口袋的開(kāi)放性，可以采用多種構象與活性位點(diǎn)相互作用，因此是最具優(yōu)化潛力的基團。該研究揭示了L-742,001二酮酸類(lèi)化合物干預 EN 的分子機制，為靶向分節段負鏈RNA病毒EN的廣譜抑制劑設計和優(yōu)化提供了重要的科學(xué)依據。
圖2. L-742,001及其衍生物IN5, IN16與EBIV EN的結合模式。EBIV EN活性位點(diǎn)參與抑制劑結合的關(guān)鍵氨基酸以白色棍狀模型顯示，L-742,001及其衍生物以黃色棍狀模型顯示，錳離子以青色球體顯示。
華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院法醫學(xué)系博士后匡文華為兩篇論文的第一作者；武漢病毒所龔鵬研究員/華中科技大學(xué)的周亦武教授、武漢病毒所胡志紅研究員/南開(kāi)大學(xué)郭宇教授，分別為兩篇論文的共同通訊作者。研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2018YFA0507200，2018YFA0507203）、中國科學(xué)院武漢國家生物安全實(shí)驗室高端用戶(hù)培育項目（2021ACCP-MS10，2020-NBL-ZD-00030，2018ACCP-ZD02），病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室開(kāi)放研究基金項目（2020IOV003），中國博士后科學(xué)基金（2018M632827），湖北江夏實(shí)驗室生物安全科技重點(diǎn)項目（JXBS001）和湖北省自然科學(xué)基金杰青項目（2021CFA050）等經(jīng)費的支持。
文章鏈接：
1. https://doi.org/10.1128/jvi.02085-21
2. https://doi.org/10.1128/jvi.02173-21